পণ্য পরিচিতি
|
পণ্যের নাম |
বিড়াল না. |
স্পেক |
|
2×ইউনিভার্সাল ব্লু SYBR সবুজ qPCR মাস্টার মিক্স (UDG সহ) |
G3328-01 |
1 মি.লি |
|
G3328-05 |
5×1 মিলি |
|
|
G3328-15 |
15×1 মিলি |
পণ্য বিবরণ
এই পণ্যটি SYBR গ্রীন I চিমেরিক ফ্লুরোসেন্স পদ্ধতি ব্যবহার করে qPCR প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য একটি বিশেষ 2× প্রিমিক্স। UDG (Uracil-DNA Glycosylase) এবং dUTP এর সংমিশ্রণে অ্যান্টিবডি-ঘেরা টাক ডিএনএ পলিমারেজের ব্যবহার কার্যকরভাবে প্রাইমার ডাইমারের গঠন হ্রাস করে, নির্দিষ্টতা বাড়ায় এবং একদিকে সংবেদনশীলতা উন্নত করে এবং পিসিআর পরিবর্ধন পণ্য দ্বারা সৃষ্ট ক্রস-দূষণ প্রতিরোধ করে। অন্যদিকে, লক্ষ্যমাত্রার আরও সঠিক পরিমাপের ফলে জিন ইতিমধ্যে, এই পণ্যটিতে রয়েছে বিশেষ ROX প্যাসিভ রেফারেন্স ডাই এবং ব্লু ভিজ্যুয়ালাইজেশন স্পাইকিং ট্রেসার ডাই, যা বিভিন্ন যন্ত্রে ROX ঘনত্ব সামঞ্জস্য করার প্রয়োজন ছাড়াই সমস্ত qPCR যন্ত্রগুলিতে প্রয়োগ করা যেতে পারে৷ হলুদ টেমপ্লেট diluent এছাড়াও প্রদান করা হয়. যখন টেমপ্লেটটি হলুদ টেমপ্লেট ডাইলুয়েন্টের সাথে মিশ্রিত করা হয় এবং নীল প্রতিক্রিয়া প্রিমিক্সে যোগ করা হয়, তখন রঙ নীল থেকে সবুজে পরিবর্তিত হয়, যা প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুত করার প্রক্রিয়াতে, বাদ দেওয়া বা ভুল সংযোজন প্রতিরোধে একটি ট্রেসার ভূমিকা পালন করতে পারে। এই নীল এবং হলুদ রঙের বর্ণালী qPCR রঞ্জকের সাথে ওভারল্যাপ করে না এবং প্রতিক্রিয়ার ফলাফলকে প্রভাবিত করে না।
স্টোরেজ এবং শিপিং শর্তাবলী
ভেজা বরফ দিয়ে জাহাজ; আলো থেকে -20 ডিগ্রি দূরে স্টোর করুন, 12 মাসের জন্য বৈধ৷
পণ্য সামগ্রী
|
কম্পোনেন্ট নম্বর |
কম্পোনেন্ট |
G3328-01 |
G3328-05 |
G3328-15 |
|
G3328-1 |
2×ইউনিভার্সাল ব্লু SYBR সবুজ qPCR মাস্টার মিক্স (UDG সহ) |
1 মি.লি |
5×1 মিলি |
15×1 মিলি |
|
G3328-2 |
40×হলুদ টেমপ্লেট ডিলিউশন বাফার |
1 মি.লি |
1 মি.লি |
1 মি.লি |
|
ম্যানুয়াল |
1 কপি |
|||
অ্যাস প্রোটোকল
1. (ঐচ্ছিক) টেমপ্লেট ডিলিউশন
হলুদ নমুনা বাফারটি ডিএনএ টেমপ্লেট পাতলা করার জন্য 40X ঘনত্বে সরবরাহ করা হয়, যা তরল রঙের পরিবর্তনের মাধ্যমে কিউপিসিআর প্রতিক্রিয়া সমাধানে টেমপ্লেটটি যোগ করা হয়েছে কিনা তা সঠিকভাবে নির্ধারণ করতে পারে। একটি উদাহরণ হিসাবে 20 μL qPCR প্রতিক্রিয়া পদ্ধতি গ্রহণ করে, 20μL qPCR প্রতিক্রিয়া সমাধানে যোগ করা তরল টেমপ্লেট পরিমাণ অনুযায়ী, মূল টেমপ্লেটের সংশ্লিষ্ট তরল পদ্ধতিটি নিম্নলিখিত সারণীতে উল্লেখ করা যেতে পারে (মূল টেমপ্লেটটিকে 100μL হিসাবে মিশ্রিত করা উদাহরণ):
|
20 μL qPCR প্রতিক্রিয়া সমাধানে (μL) পাতলা টেমপ্লেটটি যুক্ত করুন |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
100 μL টেমপ্লেট ডিলিউশন সিস্টেমে (μL) 40x হলুদ টেমপ্লেট ডিলিউশন বাফার যোগ করুন |
50 |
25 |
16.7 |
12.5 |
10 |
8.4 |
7.2 |
6.3 |
|
প্রাথমিক টেমপ্লেটে (μL) 100μL টেমপ্লেট ডিলিউশন সিস্টেম যোগ করুন |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
নিউক্লিজ যোগ করার আয়তন - বিনামূল্যে জল (μL) |
50-x |
75-x |
83.3-x |
87.5-x |
90-x |
91.6-x |
92.8-x |
93.7-x |
উদাহরণস্বরূপ: 2μL মিশ্রিত টেমপ্লেট 20 μL qPCR প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে যোগ করা উচিত। একটি উদাহরণ হিসাবে 100μL টেমপ্লেট ডিলিউশন সিস্টেম গ্রহণ। যদি মূল টেমপ্লেট ভলিউম 20μL হয়, 25μL 40x হলুদ টেমপ্লেট ডিলিউশন বাফার যোগ করা হয়, এবং তারপর নিউক্লিজ-মুক্ত জল 55μL 100μL এর মোট আয়তনে যোগ করা হয়। 40x হলুদ টেমপ্লেট ডিলিউশন বাফার এখন 10x। একটি 20-μL qPCR প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে 2μL মিশ্রিত টেমপ্লেট যোগ করুন এবং 40× হলুদ টেমপ্লেট ডিলিউশন বাফারের চূড়ান্ত ঘনত্ব হল 1x।
দ্রষ্টব্য: যদি টেমপ্লেটের ঘনত্ব খুব কম হয়, পাতলা করার দরকার নেই, বা 40x হলুদ টেমপ্লেট ডিলিউশন বাফারের সাথে মিশ্রিত টেমপ্লেট ব্যবহার করতে চান না, আপনি এই ধাপটি বাদ দিতে পারেন।
1. 2. প্রস্তাবিত qPCR প্রতিক্রিয়া সিস্টেম:
|
কম্পোনেন্ট |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
চূড়ান্ত ঘনত্ব |
|
2×ইউনিভার্সাল ব্লু SYBR সবুজ qPCR মাস্টার মিক্স (UDG সহ) |
10 μL |
25 μL |
1× |
|
ফরোয়ার্ড প্রাইমার (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
বিপরীত প্রাইমার (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
টেমপ্লেট |
পরিবর্তনশীল |
পরিবর্তনশীল |
প্রয়োজন অনুযায়ী |
|
নিউক্লিয়াস-মুক্ত জল |
20 μL যোগ করুন |
50 μL যোগ করুন |
a: সাধারণত, {{0}}.2 μM এর চূড়ান্ত ঘনত্বের সাথে একটি ভাল পরিবর্ধন প্রভাব পাওয়া যায়। প্রতিক্রিয়া কার্যক্ষমতা খারাপ হলে, প্রাইমারের ঘনত্ব 0 2-1.0 μM পরিসরে সামঞ্জস্য করা যেতে পারে।
b: সংযোজিত টেমপ্লেটের পরিমাণ টার্গেট জিনের অনুলিপির সংখ্যার উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয় এবং উপযুক্ত পরিমাণ টেমপ্লেট সংযোজন গ্রেডিয়েন্ট ডিলিউশন দ্বারা অধ্যয়ন করা হয়। 20 μL প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে টেমপ্লেট ডিএনএর সর্বোত্তম সংযোজন পরিমাণ ছিল 100 এনজির কম। যখন RT-PCR প্রতিক্রিয়ার cDNA (RT প্রতিক্রিয়া সমাধান) টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল, তখন যোগের পরিমাণ চূড়ান্ত qPCR ভলিউমের 10% এর বেশি হওয়া উচিত নয়।
2. 3. পিসিআর প্রতিক্রিয়া প্রোগ্রাম (যন্ত্র অনুসারে যথাযথভাবে সামঞ্জস্য করা যেতে পারে):
|
উ: দ্বি-পদক্ষেপ পদ্ধতি |
B. তিন ধাপের পদ্ধতি |
||||||||
|
মঞ্চ |
পদক্ষেপ |
সাইকেল নম্বর |
টেম্প erature |
সময় |
মঞ্চ |
পদক্ষেপ |
সাইকেল নম্বর |
টেম্প erature |
সময় |
|
পর্যায় 1 |
UDG ইনকিউবেশন |
1 |
50 ডিগ্রী |
2 মিনিট |
পর্যায় 1 |
UDG ইনকিউবেশন |
1 |
50 ডিগ্রী |
2 মিনিট |
|
পর্যায় 2 |
পূর্বজন্ম |
1 |
95 ডিগ্রী |
30 সেকেন্ড |
পর্যায় 2 |
Predeg শক্তি |
1 |
95 ডিগ্রী |
30 সেকেন্ড |
|
পর্যায় 3 |
বিকৃতকরণ |
40 |
95 ডিগ্রী |
15 সেকেন্ড |
পর্যায় 3 |
বিকৃতকরণ |
40 |
95 ডিগ্রী |
15 সেকেন্ড |
|
অ্যানিলিং /এক্সটেনশন |
60 ডিগ্রী |
30 সেকেন্ড |
অ্যানিলিং |
55-65 ডিগ্রি |
10 সেকেন্ড |
||||
|
এক্সটেনশন |
72 ডিগ্রী |
30 সেকেন্ড |
|||||||
|
পর্যায় 4 |
গলে যাওয়া বক্ররেখা |
1 |
যন্ত্র ডিফল্ট সেটিং |
পর্যায় 4 |
গলে যাওয়া বক্ররেখা |
1 |
যন্ত্র ডিফল্ট সেটিং |
||
a: যদি পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতা উন্নত করার প্রয়োজন হয়, দুই-পদক্ষেপ পদ্ধতি বা অ্যানিলিং তাপমাত্রা ব্যবহার করা যেতে পারে; পরিবর্ধন দক্ষতা উন্নত করতে, একটি তিন-পদক্ষেপ পদ্ধতি বা এক্সটেনশন সময় ব্যবহার করা যেতে পারে।
নোট
1. যদি পাইপটিং ট্র্যাকিং প্রয়োজন না হয়, তাহলে 40×হলুদ টেমপ্লেট ডিলিউশন বাফারের সাথে পাতলা টেমপ্লেট বাদ দেওয়া যেতে পারে।
2. ব্যবহার করার আগে অনুগ্রহ করে বিকারকগুলিকে আলতোভাবে উপরে এবং নীচে উল্টে মিশিয়ে দিন। বুদবুদ এড়াতে ঘূর্ণি এবং দোলাবেন না।
3. বিক্রিয়া মিশ্রণ প্রস্তুত করার সময় বিকারক বরফের উপর স্থাপন করা উচিত।
4. ফ্লুরোসেন্ট ডাই এসওয়াইবিআর গ্রীনের কারণে পিসিআর প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ তৈরি করার সময় শক্তিশালী আলো এড়ানো উচিত।
5. ক্রস দূষণ এড়াতে প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ তৈরির জন্য নতুন নিষ্পত্তিযোগ্য টিপস ব্যবহার করা উচিত
6. মাস্টার মিক্সের ফ্রিজ-গলানোর চক্র এড়িয়ে চলুন এবং গলানোর পরে এক মাসের মধ্যে এটি ব্যবহার করার চেষ্টা করুন।
সামঞ্জস্যপূর্ণ যন্ত্র
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ সিরিজ, সাইকোরিয়াল।
Stratagene: Mx3000P®, 3005P™,
Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina: Eco QPCR
Cepheid: SmartCycler®;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene® সিরিজ;
Roche: LightCycler™ সিরিজ;
টাকারা: থার্মাল সাইক্লার ডাইস সিরিজ;
বিশ্লেষণ: qTOWER সিরিজ;
হ্যাংজু বোরি: লাইনজিন বিভাগ;
প্রাইমার ডিজাইনের নীতিমালা
1. পরিবর্ধিত পণ্যের দৈর্ঘ্য 80-300 bp এর মধ্যে হওয়া বাঞ্ছনীয়;
2. প্রাইমারের দৈর্ঘ্য: 18-25 bp;
3. G＋C বিষয়বস্তু 40%-60% পরিসরে রাখুন।
4. ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স প্রাইমারের Tm মান 2 ডিগ্রির বেশি না হওয়া বাঞ্ছনীয়, এবং 58-62 ডিগ্রিতে Tm মান নিয়ন্ত্রণ করা ভাল;
5. বেস বিতরণের এলোমেলোতা;
6. দুটি প্রাইমারের মধ্যে চারটির বেশি পরিপূরক বা সমজাতীয় বেস থাকা উচিত নয়, অন্যথায় একটি প্রাইমার ডাইমার তৈরি হবে এবং 3' প্রান্তে পরিপূরক ওভারল্যাপ বিশেষভাবে এড়ানো উচিত;
7. এটি সুপারিশ করা হয় যে প্রাইমারের 3' শেষ বেসটি জি বা সি হওয়া উচিত;
8. NCBI বিস্ফোরণে কোনো অ-নির্দিষ্ট পণ্য প্রদর্শিত হবে না।
ঝামেলা-শুটিং
|
সমস্যার বর্ণনা |
সম্ভাব্য কারণ |
সমাধান |
|
প্রতিক্রিয়ার শেষে, কোন পরিবর্ধন বক্ররেখা উপস্থিত হয় না বা সিটি মান খুব দেরিতে উপস্থিত হয় |
টেমপ্লেট ঘনত্ব খুব কম |
একাধিক টেমপ্লেট তরলীকরণ কমাতে পরীক্ষাটি পুনরাবৃত্তি করুন এবং নমুনার ঘনত্ব অজানা থাকলে সর্বোচ্চ ঘনত্ব থেকে শুরু করুন |
|
টেমপ্লেট অবক্ষয় |
টেমপ্লেটটি আবার প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং পরীক্ষাটি পুনরাবৃত্তি হয়েছিল |
|
|
সিস্টেমে পিসিআর ইনহিবিটার আছে |
সাধারণত, টেমপ্লেটটি বহন করা হয়, টেমপ্লেটের তরল অনুপাত বাড়ানো হয় বা উচ্চ বিশুদ্ধতা সহ টেমপ্লেটটি পুনরায় প্রস্তুত করা হয় এবং পুনরাবৃত্তি করা হয় |
|
|
প্রাইমার ক্ষয় হতে পারে |
যে প্রাইমারগুলি দীর্ঘদিন ধরে ব্যবহার করা হয়নি সেগুলিকে প্রথমে PAGE ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা অখণ্ডতার জন্য পরীক্ষা করা উচিত যাতে অবক্ষয়ের সম্ভাবনা নাকচ করা যায়। |
|
|
কম পরিবর্ধন দক্ষতা |
প্রাইমারের ঘনত্ব বাড়ান, একটি তিন-পদক্ষেপ পরিবর্ধন পদ্ধতি চেষ্টা করুন, বা প্রাইমারটিকে পুনরায় ডিজাইন করুন |
|
|
পরিবর্ধন পণ্য খুব দীর্ঘ |
পরিবর্ধন পণ্যের দৈর্ঘ্য 80-300 bp পরিসরে নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল৷ |
|
|
ফাঁকা নিয়ন্ত্রণ সংকেত দেখায় |
প্রতিক্রিয়া সিস্টেম দূষণ |
প্রথমত, ফাঁকা নিয়ন্ত্রণ জল প্রতিস্থাপন করা উচিত। যদি একই অবস্থা এখনও ঘটে, তাহলে প্রাইমার, অ্যাসপিরেটর এবং পিসিআর টিউবগুলি প্রতিস্থাপন করা উচিত বা একটি নতুন মাস্টার মিক্স শুরু করা উচিত। অ্যারোসল দূষণ কমাতে একটি সুপার ক্লিন টেবিলে প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুত করা হয় |
|
প্রাইমার ডাইমারের মতো অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন প্রদর্শিত হয় |
সাধারণত, 35 চক্রের পরে পরিবর্ধন পণ্যগুলি ফাঁকা নিয়ন্ত্রণে উপস্থিত হওয়া স্বাভাবিক, যা গলানো বক্ররেখা দিয়ে বিশ্লেষণ করা উচিত। প্রাইমার পুনরায় ডিজাইন করুন, প্রাইমারের ঘনত্ব সামঞ্জস্য করুন বা পিসিআর প্রতিক্রিয়া পদ্ধতি অপ্টিমাইজ করুন |
|
|
গলে যাওয়া বক্ররেখার একাধিক চূড়া রয়েছে |
প্রাইমার ডিজাইন খারাপ |
প্রাইমার ডিজাইনের নীতি অনুসারে নতুন প্রাইমারটি পুনরায় ডিজাইন করা হয়েছিল |
|
প্রাইমারের ঘনত্ব খুব বেশি |
প্রাইমারের ঘনত্ব যথাযথভাবে হ্রাস করুন |
|
|
সিডিএনএ টেমপ্লেটে জিনোমিক দূষণ রয়েছে |
নিষ্কাশিত আরএনএ দ্রবণটি ডিএনএ এনজাইম ব্যবহার করে হজম করা হয়, যেমন dsDNase, জিনোমিক দূষণ অপসারণ করতে বা ট্রান্সিন্ট্রন প্রাইমার ডিজাইন করতে। |
|
|
পরীক্ষার দুর্বল প্রজননযোগ্যতা |
নমুনা যোগ করার ত্রুটি বড় |
সঠিক পাইপেট ব্যবহার, উচ্চ মানের স্তন্যপান মাথা সঠিক পাইপেট সঙ্গে; উচ্চ পাতলা টেমপ্লেট, নমুনা ত্রুটি কমাতে বড় ভলিউম টেমপ্লেট যোগ করা; কিউপিসিআর-এর প্রতিক্রিয়ার পরিমাণ বাড়ানো হয়েছিল |
|
টেমপ্লেট ঘনত্ব খুব কম |
টেমপ্লেটের পাতলা করার সময় কমাতে পরীক্ষার পুনরাবৃত্তি করুন |
|
|
qPCR যন্ত্রের বিভিন্ন স্থানে তাপমাত্রার বিচ্যুতি |
qPCR যন্ত্র নিয়মিত ক্যালিব্রেট করুন |
|
|
পরিবর্ধন বক্ররেখা মসৃণ নয় |
ফ্লুরোসেন্স সংকেত খুব দুর্বল, সিস্টেম সংশোধনের পরে উত্পাদিত হয় |
নিশ্চিত করুন যে মাস্টার মিক্সে প্রিমিক্স করা রঞ্জকগুলি খারাপ না হয়; ভাল qPCR ভোগ্য সামগ্রী সংগ্রহ করতে ফ্লুরোসেন্ট সংকেত প্রতিস্থাপন করুন |
|
অ্যামপ্লিফিকেশন কার্ভ ব্রেক বা স্লিপ |
টেমপ্লেটের ঘনত্ব বেশি ছিল এবং বেসলাইন এন্ডপয়েন্টের মান সিটি মানের চেয়ে বেশি ছিল |
বেসলাইন এন্ডপয়েন্ট (Ct মান -3) হ্রাস করা হয়েছিল এবং ডেটা পুনরায় বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷ |
|
পৃথক ওয়েলস এর প্রশস্তকরণ বক্ররেখা হঠাৎ তীব্রভাবে নেমে গেছে |
প্রতিক্রিয়া নল মধ্যে বুদবুদ আছে |
নিশ্চিত করুন যে MIX সম্পূর্ণরূপে দ্রবীভূত হয়েছে, এবং সমানভাবে ঘূর্ণায়মান এবং দোলাবেন না; নমুনা যোগ করার পরে, বুদবুদগুলি হালকা ইলাস্টিক দিয়ে সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সরানো হয়। বুদবুদ অপসারণ করার জন্য প্রাক-ডিনাচুরেশন সময় 10 মিনিট পর্যন্ত বাড়ানো হয়েছিল |
শুধুমাত্র গবেষণা ব্যবহারের জন্য!
গরম ট্যাগ: 2×সর্বজনীন নীল sybr সবুজ qpcr মাস্টার মিশ্রণ (udg সহ), চায়না 2×সর্বজনীন নীল sybr সবুজ qpcr মাস্টার মিশ্রণ (udg সহ) প্রস্তুতকারক, সরবরাহকারী, কারখানা
