পণ্য পরিচিতি
|
পণ্যের নাম |
বিড়াল না. |
স্পেক |
|
ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন কিট (প্রোটিন এ অ্যাগারোজ) |
G2215-50T |
50 T |
পণ্যের বিবরণ/পরিচয়
আইপি বা কো-আইপি হল প্রোটিন বা প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া (পিপিআই) অধ্যয়ন করার জন্য একটি সাধারণ পরীক্ষামূলক কৌশল যা নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে এবং একটি মাধ্যম যা অ্যান্টিবডিগুলিকে আবদ্ধ করে (যেমন প্রোটিন A/G Agarose বা প্রোটিন A/G Magrose), অথবা সরাসরি ব্যবহার করে মাঝারি নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি (যেমন অ্যাগারোজ বা চৌম্বক পুঁতি) সঙ্গে মিলিত এবং তারপর জটিল প্রোটিন নমুনা থেকে অ্যান্টিজেন-অ্যান্টিবডি কমপ্লেক্সগুলিকে বিচ্ছিন্ন করে সেন্ট্রিফিউগেশন বা চৌম্বকীয় শক্তি, যাতে লক্ষ্য প্রোটিনগুলির বিচ্ছিন্নতা এবং বিশুদ্ধকরণের উদ্দেশ্য অর্জন করা যায়, যা পরবর্তীতে ওয়েস্টার্ন ব্লট বা ভর স্পেকট্রোমেট্রির জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। প্রোটিন A হল একটি কোষ প্রাচীরের পৃষ্ঠের প্রোটিন যা 42 kDa এর আণবিক ওজন সহ স্ট্যাফিলোকক্কাস অরিয়াসে পাওয়া যায়। প্রোটিন জি হল একটি ইমিউনোগ্লোবুলিন বাইন্ডিং প্রোটিন যা স্ট্রেপ্টোকক্কাল ব্যাকটেরিয়া টাইপ C বা G দ্বারা প্রকাশ করা হয়। প্রোটিন A এবং প্রোটিন G কার্যত একই রকম এবং বিশেষভাবে স্তন্যপায়ী ইমিউনোগ্লোবুলিন (Ig) এর সাথে আবদ্ধ হতে পারে। রিকম্বিনেন্ট প্রোটিন A এবং G যথাযথ পরিবর্তনের সাথে অ্যাগারোজের সাথে আবদ্ধ ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বা অ্যান্টিবডি পরিশোধনের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। প্রোটিন A agarose মানুষের IgG1, IgG2, IgG4, মাউস IgG2a, IgG2b এর ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের জন্য উপযুক্ত, যখন প্রোটিন G অ্যাগারোজ জপমালা মানুষের IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2, IgG2, মাউস IgG2, IgG2, IgG2, এর ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের জন্য উপযুক্ত। ইঁদুর IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি। (নির্দিষ্ট তথ্যের জন্য সারণি I দেখুন)
এই পণ্যটি স্ব-উন্নত এবং উত্পাদিত প্রোটিন A লেবেলযুক্ত অ্যাগারোজ গ্রহণ করে, বাজারের অনুরূপ পণ্যগুলির সাথে তুলনা করে, এই পণ্যটি অ্যান্টিবডিগুলিকে আরও দক্ষতার সাথে আবদ্ধ করে এবং একটি কম অ-নির্দিষ্ট বাঁধাইয়ের হার রয়েছে, অপ্টিমাইজ করা বাফারের সাথে এটি সুবিধাজনক এবং দক্ষ হতে পারে। ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন পরীক্ষার জন্য; এটি সেল লাইসেটস, সেলুলার সিক্রেশন সুপারন্যাট্যান্টস, সিরাম, অ্যাসাইটস ইত্যাদির মতো নমুনাগুলিতে লক্ষ্য প্রোটিনগুলির বিচ্ছিন্নতা এবং পরিশোধনে ব্যাপকভাবে ব্যবহার করা যেতে পারে; এই কিটটি লক্ষ্য প্রোটিন নির্মূল করার জন্য দুটি ইলুশন পদ্ধতি (ডিনাচারিং ইলিউশন এবং অ্যাসিড ইলিউশন) সরবরাহ করে, বিশেষ করে অ্যাসিড ইলিউশনে অ্যান্টিবডির হালকা এবং ভারী চেইন থাকবে না, যা কার্যকরভাবে অ্যান্টিবডির ভারী এবং হালকা হস্তক্ষেপের সমস্যা সমাধান করতে পারে। ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন এবং প্রোটিন ইমিউনোব্লটিং পরীক্ষায় চেইন।
পণ্য তথ্য
|
বৈশিষ্ট্য |
বর্ণনা |
|
পণ্য সামগ্রী |
নির্দিষ্ট প্রতিরক্ষামূলক বাফারে 50%(v/v) অ্যাগারোজ |
|
জপমালা গঠন |
6% ক্রস-লিঙ্কড আগারোজ |
|
সংযুক্ত প্রোটিন |
প্রোটিন এ |
|
মেগাওয়াট প্রোটিন |
~25 kDa(প্রোটিন A) |
|
বাঁধাই প্রোটিন ক্ষমতা |
>1 মিলিগ্রাম মাউস অ্যান্টিবডি প্রতি মিলি পুঁতি |
|
বিশেষত্ব |
ইঁদুর, মানুষ, ইঁদুর, ছাগল, ভেড়া এবং গবাদি পশু সহ বিভিন্ন প্রজাতির অ্যান্টিবডি |
|
গুটিকা ব্যাস |
30~150 μm |
|
ইলিউশন পদ্ধতি |
অ্যাসিড সহ ইলুশন, বা 1x SDS-PAGE লোডিং বাফার (হ্রাস করা) দ্রষ্টব্য: 1x SDS-PAGE লোডিং বাফার (হ্রাস করা হলে), অ্যান্টিবডির ভারী চেইন (~ 50kDa) এবং হালকা চেইন (~ 25kDa) বিকৃত করা হবে এবং আগারোজ পুঁতি থেকে ছেড়ে দেওয়া হবে। |
|
অ্যাপ্লিকেশন |
আইপি, কো-আইপি, প্রোটিন পরিশোধন |
স্টোরেজ এবং শিপিং শর্তাবলী
ভেজা বরফ দিয়ে জাহাজ; 5×SDS-PAGE লোডিং বাফার (হ্রাস করা) 12 মাসের জন্য -20 ডিগ্রি এবং অন্যটিকে 2-8 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করতে হবে।
পণ্য উপাদান
|
কম্পোনেন্ট নম্বর |
কম্পোনেন্ট |
G2215-50T |
স্টোরেজ তাপমাত্রা |
|
G2038 |
আইপি লাইসিস বাফার |
50 মি.লি |
2-8 ডিগ্রি |
|
G0015 |
10×TBS |
5 মি.লি |
2-8 ডিগ্রি |
|
G2215-1 |
SweAgarose প্রোটিন A |
1 মি.লি |
2-8 ডিগ্রি |
|
G2215-2 |
অ্যাসিড ইলিউশন বাফার |
10 মিলি |
2-8 ডিগ্রি |
|
G2215-3 |
নিউলাইজেশন ইলিউশন বাফার |
1 মি.লি |
2-8 ডিগ্রি |
|
G2013 |
5x SDS-PAGE লোডিং বাফার (কমানো) |
1 মি.লি |
-20 ডিগ্রি |
|
ম্যানুয়াল |
1 পিসি |
||
অতিরিক্ত রিএজেন্ট প্রয়োজন
|
পণ্যের নাম |
বিড়াল সংখ্যা |
স্পেক |
|
50×ককটেল প্রোটিজ ইনহিবিটার |
জি2006-250উল |
250 μL |
|
PBS,1×(ফসফেট বাফার স্যালাইন) |
G4202-500ML |
500 মি.লি |
অ্যাস প্রোটোকল/প্রক্রিয়া
1. কিট প্রস্তুতি
ক) নীচের সারণীটি পড়ুন, প্রতি নমুনায় লাইসেটের 100-500 μL অনুপাতে প্রাসঙ্গিক বিকারকগুলি প্রস্তুত করুন;
|
ধাপ |
সমাধান প্রয়োজন |
আয়তন |
আয়তন |
|
সেল লাইসিস এবং প্রস্তুতি |
আইপি লাইসেট ককটেল প্রোটিজ ইনহিবিটর ধারণকারী |
100 μL |
500 μL |
|
আইপি |
SweAgarose প্রোটিন A |
4 μL |
20 μL |
|
তিনবার ধোয়া |
1×TBS |
100 μL |
500μL |
|
অ্যাসিড ইলিউশন এবং নিরপেক্ষকরণ |
অ্যাসিড ইলিউশন বাফার |
20 μL |
100 μL |
|
নিরপেক্ষকরণ বাফার |
20 μL |
100 μL |
|
|
ডিনাচারিং ইলুশন |
1x SDS-PAGE লোডিং বাফার (কমানো) |
20 μL |
100 μL |
খ) প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী আইপি লাইসেট তৈরি: উপরের সারণীটি পড়ুন, লাইসিসের জন্য প্রতি 0।{2}} মিলিয়ন কোষ ধারণকারী আইপি লাইসেটের {{0}} μL ব্যবহার করুন; 50x ককটেল প্রোটেজ ইনহিবিটর (G2006-250UL বাঞ্ছনীয়) এর সাথে 50:1 অনুপাতে আইপি লাইসেট মিশ্রিত করুন, উদাহরণস্বরূপ, 50x ককটেল প্রোটেজ ইনহিবিটরের 20 μL যোগ করুন 1 মিলি আইপি লাইসেটে, তারপর 1 এমএল প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী IP lysate প্রাপ্ত করা হবে; ইনহিবিটর ধারণকারী প্রস্তুত আইপি লাইসেট একটি বরফ স্নান বা 4 ডিগ্রী এ স্থাপন করা উচিত
গ) দ্রষ্টব্য: যদি ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের টার্গেট প্রোটিনে ফসফোরিলেশন বা অ্যাসিটিলেশন পরিবর্তন জড়িত থাকে, তাহলে ফসফেটেস ইনহিবিটর বা ডিসিটাইলেজ ইনহিবিটর যোগ করা উচিত (স্ব-প্রদান করা); ইনহিবিটর ধারণকারী IP lysate ব্যবহারের আগে প্রস্তুত করা উচিত, এবং হিমায়িত করা উচিত নয় এবং পরবর্তী ব্যবহারের জন্য ধরে রাখা উচিত নয়।
d) 1×TBS তৈরি: অতি-বিশুদ্ধ জল দিয়ে 10×TBS বাফার 1×TBS-এ পাতলা করুন। উদাহরণ স্বরূপ, 10×TBS বাফারের 1 mL 9 mL অতি-বিশুদ্ধ জলে যোগ করুন, যা ভালভাবে মেশানোর পর 1×TBS বাফার।
e) 1x SDS-PAGE লোডিং বাফারের প্রস্তুতি (হ্রাস করা): 1x SDS-PAGE লোডিং বাফার (হ্রাস) করার জন্য একটি উপযুক্ত পরিমাণ 5x SDS-PAGE লোডিং বাফার (হ্রাস) 5 বার অতি-বিশুদ্ধ জল দিয়ে পাতলা করা হয়েছিল; উদাহরণস্বরূপ, 5x প্রোটিন বাফারের 0.2mL মিশ্রিত করুন (হ্রাস) 0.8 মিলি অতি-বিশুদ্ধ জল, যা 1x SDS-PAGE লোডিং বাফার (হ্রাস)।
2. অ্যান্টিজেন নমুনা প্রস্তুতি
ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বা ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন পরীক্ষাগুলি নমুনাগুলি লাইজ করার পরে অবিলম্বে করা উচিত, যদি না হয়, নমুনাগুলি রেফ্রিজারেটরে -20 ডিগ্রি বা -80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা যেতে পারে, তবে হিমায়িত এবং গলানো প্রোটিন-প্রোটিনের মিথস্ক্রিয়াকে প্রভাবিত করতে পারে; প্রোটিনের ক্ষয় কমানোর জন্য সমস্ত নমুনা লাইসিস ধাপগুলিকে বরফের স্নানে বা 4 ডিগ্রিতে চালানো উচিত, এবং পরবর্তী সনাক্তকরণের জন্য নমুনা প্রস্তুত করার পরে একটি নির্দিষ্ট পরিমাণ নমুনা ইনপুট বা মোট হিসাবে নেওয়া উচিত। ওয়েস্টার্ন ব্লট।
টিস্যু নমুনার জন্য:
ক) অতিরিক্ত রক্ত পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে অপসারণের জন্য টিস্যুগুলিকে প্রাক-ঠান্ডা পিবিএস (G4202 প্রস্তাবিত) দিয়ে ধুয়ে ফেলতে হবে। বরফের উপর হোমোজেনাইজারে ছোট ছোট টুকরো করে ওজন করুন এবং কিমা করুন।
খ) টিস্যুর প্রতি 10-20 মিগ্রা প্রতি 100-200 μL অনুপাতে প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী IP লাইসেট যোগ করুন, অথবা প্রোটিনের উচ্চ ঘনত্বের প্রয়োজন হলে IP লাইসেটের পরিমাণ কমিয়ে দিন।
গ) একটি গ্লাস হোমোজেনাইজার বা হ্যান্ডহেল্ড হোমোজেনাইজার দিয়ে হোমোজেনাইজ করুন বা সম্পূর্ণ গ্রাইন্ডিংয়ের জন্য আমাদের স্ব-উন্নত KZ-III-F নিম্ন-তাপমাত্রার গ্রাইন্ডার ব্যবহার করুন।
ঘ) হোমোজেনেটকে 1.5 মিলি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, ঝাঁকান এবং মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য বরফ-স্নান করা হয়েছিল, টিস্যু কোষগুলির সম্পূর্ণ লাইসিস নিশ্চিত করার জন্য প্রতি 10 মিনিটে একটি পিপেট দিয়ে পুনরাবৃত্ত করা হয়েছিল।
e) 12,000 xg এ 5 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রীতে সেন্ট্রিফিউজ করুন, পরবর্তী ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বা ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন পরীক্ষার জন্য প্রসিপিটেট এবং অ্যাসপিরেট সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন।
অনুগত কোষ নমুনার জন্য:
ক) প্রয়োজনে, কোষগুলিকে পিবিএস দিয়ে 2-3 বার ধোয়া যায়, শেষ সময়ে অবশিষ্ট তরলটি পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে শোষণ করে।
খ) সেল স্ক্র্যাপার দিয়ে কোষগুলিকে স্ক্র্যাপ করুন বা ট্রিপসিন কোষগুলিকে সম্পূর্ণরূপে স্থগিত করার জন্য ডাইজেস্ট করুন, সেগুলিকে 1.5 মিলি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে সংগ্রহ করুন এবং 1,000 xg এ 5 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রিতে সেন্ট্রিফিউজ করুন, সুপারনাট্যান্টকে বাদ দিন কোষের অবক্ষয় সংগ্রহ করুন।
c) প্রতি 0 প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী IP lysate-এর {{0}} μL যোগ করুন। যথোপযুক্তভাবে ফুঁ দিন এবং কোষগুলিকে সম্পূর্ণরূপে লাইজ করার জন্য 3-5 মিনিটের জন্য বরফ স্নান করুন, এবং সম্পূর্ণরূপে লাইজড হওয়ার পরে কোনও স্পষ্ট সেলুলার বৃষ্টিপাত হওয়া উচিত নয়; যদি কোষের পরিমাণ বড় হয়, তবে এটি সুপারিশ করা হয় যে কোষগুলিকে 0৷{6}} মিলিয়ন কোষ/টিউব সম্পূর্ণরূপে লাইসিসে বিভক্ত করা হবে৷
d) পর্যাপ্ত লাইসিসের পর, 12,000 xg-এ 5 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রিতে সেন্ট্রিফিউজ করুন, পরবর্তী ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বা ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন পরীক্ষার জন্য প্রসিপিটেট এবং অ্যাসপিরেট সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন।
সাসপেন্ড সেল নমুনার জন্য:
ক) সেন্ট্রিফিউজ 1,000 xg 5 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রীতে অবক্ষেপ সংগ্রহ করতে; যদি প্রয়োজন হয়, একবার পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলুন, তারপর অবশিষ্ট তরলটি অ্যাসপিরেট করুন এবং যতটা সম্ভব কোষগুলিকে ছড়িয়ে দেওয়ার জন্য আলতো করে ঘূর্ণি করুন।
b) প্রতি 0 প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী IP lysate-এর {{0}} μL যোগ করুন। সঠিকভাবে ফুঁ দিন এবং বরফ স্নান করুন 3-5 মিনিটের জন্য কোষগুলিকে সম্পূর্ণরূপে লাইজ করার জন্য; যদি কোষের পরিমাণ বড় হয়, তবে এটি সুপারিশ করা হয় যে কোষগুলিকে 0৷{6}} মিলিয়ন কোষ/টিউব সম্পূর্ণরূপে লাইসিসে বিভক্ত করা হবে৷
গ) 5 মিনিটের জন্য বরফ স্নান, 5 মিনিটের জন্য 12000 গ্রাম 4 ডিগ্রিতে সেন্ট্রিফিউগেশন, সুপারনাট্যান্ট নিন, অর্থাৎ, মোট প্রোটিন দ্রবণ, যা পরবর্তী ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বা ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
ব্যাকটেরিয়া বা খামির নমুনার জন্য:
ক) 1 মিলি ব্যাকটেরিয়া বা ইস্ট দ্রবণ নিন এবং সুপারনাট্যান্ট অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করুন। প্রয়োজনে, কোষগুলি একবার পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া যেতে পারে, শেষ সময়ে অবশিষ্ট তরলটি পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে শোষণ করে। যতটা সম্ভব কোষগুলিকে ছড়িয়ে দিতে টিউবের নীচে আলতোভাবে ঘূর্ণি বা ফ্লিক করুন।
b) প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী IP lysate এর 100-200 μL যোগ করুন এবং ব্যাকটেরিয়া বা ছত্রাককে সম্পূর্ণরূপে ছড়িয়ে দিতে আলতোভাবে ঘা দিন।
গ) 10 মিনিটের জন্য বরফ স্নান, ভাল লাইসিসের জন্য, ব্যাকটেরিয়া এবং খামির যথাক্রমে লাইসোজাইম এবং প্রাচীর-ভাঙা এনজাইম (স্ব-প্রদানকৃত) দিয়ে হজম করা যেতে পারে, এবং তারপর প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী আইপি লাইসেট দিয়ে লাইস করা যেতে পারে।
d) 12,000 xg-এ 5 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রিতে সেন্ট্রিফিউজ করুন, পরবর্তী ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বা ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন পরীক্ষার জন্য প্রসিপিটেট এবং অ্যাসপিরেট সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন।
3. Agarose প্রস্তুতি
ক) যতটা সম্ভব একটি সমজাতীয় পুঁতির বিচ্ছুরণ তৈরি করতে স্বেআগারোজ প্রোটিন A পুঁতিকে আলতোভাবে পুনরুদ্ধার করুন, প্রতি 500 উল নমুনার জন্য 20 উল ভালভাবে মিশ্রিত পুঁতির বিচ্ছুরণ যোগ করুন, উপযুক্ত পরিমাণে অ্যাগারোজ পুঁতি নিন EP টিউব পরিষ্কার করুন এবং 0.5 মিলি (20 ul পুঁতির বিচ্ছুরণ) এর চূড়ান্ত আয়তনে 1x TBS যোগ করুন প্রতিটি নমুনার জন্য একটি উদাহরণ হিসাবে নিম্নলিখিত ইমিউনোপ্রেসপিটেশন ধাপে ব্যবহার করা হয়)।
খ) আলতোভাবে পুঁতিগুলিকে পুনরায় সাসপেন্ড করুন, 6 এ সেন্ট্রিফিউজ করুন, 4 ডিগ্রীতে 30 সেকেন্ডের জন্য x000×g, সাবধানে সুপারনাট্যান্টটি সরিয়ে দিন এবং উপরের ধাপগুলি দুবার পুনরাবৃত্তি করুন।
গ) পুঁতিগুলিকে 1x টিবিএস দিয়ে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল প্রাথমিক পুঁতির বিচ্ছুরণের পরিমাণ অনুসারে।
4. অ্যান্টিবডি SweAgarose প্রোটিন A জপমালা বাঁধাই
ক) অ্যান্টিবডি প্রস্তুতি: অ্যান্টিবডি নির্দেশাবলীতে প্রস্তাবিত তরল অনুপাত অনুসারে অ্যান্টিবডি কার্যকরী দ্রবণ প্রস্তুত করতে 1x TBS দিয়ে অ্যান্টিবডিকে পাতলা করুন, বা 5-50 ug/mL এর চূড়ান্ত ঘনত্বের সাথে অ্যান্টিবডি কার্যকরী দ্রবণে অ্যান্টিবডি প্রস্তুত করুন। , যা বরফের উপর প্রস্তুত করা যেতে পারে; ঐচ্ছিক: একই অ্যান্টিবডি প্রজাতির স্বাভাবিক IgG ব্যবহার করুন একই পাতলা অনুপাত বা 5-50 ug/mL এর চূড়ান্ত ঘনত্বের সাথে স্বাভাবিক IgG কার্যকারী সমাধান প্রস্তুত করতে, অ-নির্দিষ্ট বাঁধাই অপসারণ করুন বা একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে পরিবেশন করুন। একই প্রজাতির স্বাভাবিক IgG মানে যদি পরবর্তী ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনে ব্যবহৃত অ্যান্টিবডিটি মাউস IgG হয়, তাহলে ব্যাকগ্রাউন্ড কমাতে বা নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে এই ধাপে স্বাভাবিক মাউস IgG-এর একটি উপযুক্ত পরিমাণ 1x TBS দিয়ে মিশ্রিত করা যেতে পারে।
খ) অ্যান্টিবডি শোষণ: ধাপ 3 এ প্রস্তুত করা SweAgarose প্রোটিন A পুঁতিগুলিকে 6-এ সেন্ট্রিফিউজের মাধ্যমে আলাদা করুন,000 xg 30 সেকেন্ডের জন্য 4 ডিগ্রিতে, সুপারনাট্যান্টকে অ্যাসপিরেট করুন, 500 μL অ্যান্টিবডি কার্যকরী দ্রবণ বা সাধারণ IgG কার্যকরী দ্রবণ যোগ করুন, পুনরুদ্ধার করুন এবং তারপর একটি টার্নওভার মিক্সারে ঘরের তাপমাত্রায় 15-60 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন।
দ্রষ্টব্য: যথাযথ পরিমাণে অ্যান্টিবডি বা সাধারণ IgG দিয়ে সরাসরি ধাপ 3-এ প্রস্তুত SweAgarose প্রোটিন A পুঁতিগুলিকে ইনকিউবেট করাও সম্ভব।
গ) পুঁতি আলাদা করা এবং ধোয়া: ইনকিউবেটেড পুঁতিগুলিকে 6,000 xg 4 ডিগ্রিতে 30 সেকেন্ডের জন্য সেন্ট্রিফিউজের মাধ্যমে আলাদা করুন, সুপারনাট্যান্টকে অ্যাসপিরেট করুন, 500 μL 1×TBS যোগ করুন, স্বেএগারোজ প্রোটিন A পুঁতিগুলিকে আলতো করে ফুঁ দিয়ে পুনরায় চালু করুন একটি পাইপেট, সেন্ট্রিফিউজ 6 এ,000 4 ডিগ্রীতে 30 সেকেন্ডের জন্য xg , সুপারন্যাট্যান্ট সরান, তিনবার ধোয়ার পুনরাবৃত্তি করুন এবং প্রাথমিক ভলিউমের মতো একই পরিমাণে 1×TBS দিয়ে পুঁতিগুলি পুনরায় সাসপেন্ড করুন।
দ্রষ্টব্য: যদি পুঁতিগুলি ইনকিউবেশন এবং ধোয়ার সময় জমাটবদ্ধ বা ফ্ল্যাকি হয় তবে এটি একটি স্বাভাবিক ঘটনা এবং পরীক্ষামূলক ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করবে না।
5. ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন (আইপি):
ক) অ-নির্দিষ্ট বাঁধাই অপসারণ (ঐচ্ছিক): ধাপ 4 এ প্রস্তুত করা SweAgarose প্রোটিন A পুঁতি, যা স্বাভাবিক আইজিজিকে আবদ্ধ করে, নমুনাগুলির সাথে 4 ডিগ্রিতে 60 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ দ্বারা আলাদা করা হয়,000 4 ডিগ্রীতে 30 সেকেন্ডের জন্য xg , এবং পরবর্তী পরীক্ষার জন্য সুপারন্যাট্যান্ট ব্যবহার করা হয়; এই পদক্ষেপের উদ্দেশ্য হল প্রোটিনগুলিকে অপসারণ করা যা বিশেষভাবে স্বাভাবিক IgG এর সাথে আবদ্ধ নয়।
খ) অ্যান্টিবডি বা স্বাভাবিক IgG-এর সাথে সংযুক্ত SweAgarose প্রোটিন A পুঁতি দিয়ে স্যাম্পেলের ইনকিউবেশন: প্রতি 500 ul প্রোটিনের নমুনার জন্য 20 ul বিড সাসপেনশন অনুপাতে অ্যান্টিবডি বা স্বাভাবিক IgG-এর সাথে সংযুক্ত SweAgarose প্রোটিন A পুঁতি যোগ করুন, একটি পাশে রাখুন- দোদুল্যমান শেকার বা একটি ঘূর্ণমান মিক্সার, এবং ঘরে 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করুন তাপমাত্রা বা রাতারাতি 4ºC।
দ্রষ্টব্য 1: যদি পুঁতিগুলি ইনকিউবেশন এবং ধোয়ার সময় জমাটবদ্ধ বা ফ্ল্যাকি হয় তবে এটি একটি স্বাভাবিক ঘটনা এবং পরীক্ষামূলক ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করবে না।
দ্রষ্টব্য 2: বিকল্পভাবে, নমুনার সাথে উপযুক্ত পরিমাণে অ্যান্টিবডি বা স্বাভাবিক IgG ঘরের তাপমাত্রায় 1-2 ঘন্টা বা রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে ইনকিউব করা যেতে পারে এবং তারপরে অ্যাগারোজ বিড সাসপেনশনের 10-20 μL যোগ করা যেতে পারে। এবং কক্ষ তাপমাত্রায় 60 মিনিটের জন্য incubated.
গ) সেন্ট্রিফিউজ: ইনকিউবেশনের পর, সুপারনেট্যান্ট অপসারণের জন্য 6,000 xg 4 ডিগ্রিতে 30 সেকেন্ডে সেন্ট্রিফিউজ।
দ্রষ্টব্য: ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের প্রভাব পরীক্ষা করতে সুপারনাট্যান্টের একটি অংশ ধরে রাখুন।
d) ধোয়া: 1×TBS এর 500 ul যোগ করুন, একটি পাইপেট দিয়ে পুনরুদ্ধার করা পুঁতিগুলিকে আলতো করে ফুঁ দিন, 6,000 xg 4 ডিগ্রিতে 30 সেকেন্ডে সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং সুপারনাট্যান্ট অপসারণ করুন এবং তিনবার ধোয়ার পুনরাবৃত্তি করুন।
দ্রষ্টব্য: আপনি ওয়াশিং বাফারের OD280ও পরীক্ষা করতে পারেন যে ওয়াশিং সম্পূর্ণ হয়েছে কিনা, যদি OD280 0.05-এর বেশি হয়, তাহলে ধোয়ার সময়ের সংখ্যা যথাযথভাবে বাড়ানো উচিত।
6. ইলিউশন
লক্ষ্য প্রোটিনের বৈশিষ্ট্য এবং পরবর্তী পরীক্ষা-নিরীক্ষার প্রয়োজনীয়তার উপর নির্ভর করে, নিম্নোক্ত পদ্ধতিগুলির মধ্যে একটি নির্মূলের জন্য নির্বাচন করা যেতে পারে।
ক) ডিনাচারিং ইলুশন পদ্ধতি: এই পদ্ধতির দ্বারা নির্গত নমুনাগুলি SDS-PAGE-এর জন্য উপযুক্ত। সেন্ট্রিফিউজের পরে টিউবে 1× প্রোটিন স্যাম্পলিং বাফারের 25 µL যোগ করুন, 5 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রীতে তাপ দিন এবং তারপর পশ্চিমী দাগ সনাক্তকরণের জন্য সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করতে সেন্টিফিউজ করুন।
খ) অ্যাসিড নির্গমন: এই পদ্ধতির দ্বারা নির্গত নমুনা তার মূল জৈবিক কার্যকলাপ ধরে রাখে এবং কার্যোত্তর বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। সেন্ট্রিফিউজের পরে টিউবে 20 µL অ্যাসিড ইলুশন বাফার যোগ করুন, ভালভাবে মেশান এবং 10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করুন, তারপর একটি নতুন EP টিউবে সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করতে সেন্ট্রিফিউজ করুন, এবং পিএইচ সামঞ্জস্য করতে অবিলম্বে 2 μL নিউলাইজেশন ইলিউশন বাফার যোগ করুন। নিরপেক্ষ থেকে eluted পণ্য, যা পোস্ট-কার্যকরী বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
দ্রষ্টব্য: ব্যবহারকারী পছন্দসই ভলিউম অনুযায়ী যোগ করা ইলুশন বাফারের পরিমাণ সামঞ্জস্য করতে পারে।
দ্রষ্টব্য
1. SweAgarose প্রোটিন A কে কিটে -20 ডিগ্রীতে সংরক্ষণ করবেন না বা বারবার জমাট বাঁধবেন এবং গলাবেন না, অন্যথায় এটি চৌম্বক পুঁতির কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করবে এবং অপ্রয়োজনীয় পরীক্ষামূলক ত্রুটি সৃষ্টি করবে।
2. ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন পদ্ধতি সম্পাদন করার আগে দয়া করে এই নির্দেশাবলী সাবধানে পড়ুন।
3. যদি ইমিউনোপ্রিসিপিটেটেড টার্গেট প্রোটিনের মধ্যে ফসফোরিলেশন বা অ্যাসিটিলেশন পরিবর্তন জড়িত থাকে, তাহলে উপযুক্ত ফসফেটেস ইনহিবিটর এবং ডিসিটাইলেজ ইনহিবিটর সরবরাহ করা উচিত।
4. পিএইচ 6-8 এ পুঁতি বজায় রাখুন, উচ্চ গতির সেন্ট্রিফিউগেশন, শুকানো বা জমাট বাঁধা এড়িয়ে চলুন, যা পুঁতির জমাট বাঁধতে পারে।
5. পুঁতিগুলি ব্যবহারের আগে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা উচিত, মিক্সিং অপারেশনটি মৃদু হওয়া উচিত এবং অ্যান্টিবডির বিকৃতকরণ এড়াতে হিংসাত্মক ঘূর্ণায়মান এবং ঝাঁকুনির শিকার হওয়া উচিত নয়।
6. ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনে ইতিবাচক এবং নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ (SweAgarose Mouse IgG) সুপারিশ করা হয়।
7. প্রোটিন নমুনা সংগ্রহের পরে যত তাড়াতাড়ি সম্ভব বিশুদ্ধ করা উচিত এবং প্রোটিনের ক্ষয় বা বিকৃতকরণ কমাতে সর্বদা 4 ডিগ্রি বা বরফের স্নানে রাখা উচিত।
8. অ্যাসিড ইলুশন ব্যবহার করলে অ্যাগারোজ পুঁতি সংগ্রহ করতে পারে, যা একটি স্বাভাবিক ঘটনা এবং চৌম্বক পুঁতির স্বাভাবিক ব্যবহারকে প্রভাবিত করে না।
9. এই পণ্যটি পেশাদারদের দ্বারা বৈজ্ঞানিক গবেষণা ব্যবহারের জন্য সীমাবদ্ধ, এবং ক্লিনিকাল রোগ নির্ণয় বা চিকিত্সা, খাদ্য বা ওষুধ, বা একটি সাধারণ বাসস্থানে সংরক্ষণের জন্য ব্যবহার করা যাবে না।
10. উপযুক্ত প্রতিরক্ষামূলক পোশাক পরুন যেমন ল্যাবরেটরি ওভারঅল, নিরাপত্তা চশমা এবং গ্লাভস।
11. বিভিন্ন জেনেরিক উত্স এবং উপপ্রকারের অ্যান্টিবডিগুলির সাথে প্রোটিন A এবং প্রোটিন G-এর বাঁধন ক্ষমতা সারণী I তে দেখানো হয়েছে৷
টেবিল 1
|
প্রজাতি |
আইজি |
প্রোটিন এ |
প্রোটিন জি |
মোট আইজি |
প্রোটিন এ |
প্রোটিন জি |
|
মানব |
IgG1 |
++++ |
++++ |
মানব |
++++ |
++++ |
|
IgG2 |
++++ |
++++ |
মাউস |
+++ |
+++ |
|
|
IgG3 |
- |
++++ |
ইঁদুর |
+/- |
++ |
|
|
IgG4 |
++++ |
++++ |
খরগোশ |
++++ |
+++ |
|
|
আইজিএ |
++ |
- |
ছাগল |
- |
++ |
|
|
আইজিডি |
++ |
- |
চিকেন |
- |
+ |
|
|
আইজিই |
++ |
- |
গরু |
++ |
++++ |
|
|
আইজিএম |
++ |
- |
গিনি পিগ |
++++ |
++ |
|
|
মাউস |
IgG1 |
+ |
++++ |
হ্যামস্টার |
+ |
++ |
|
IgG2a |
++++ |
++++ |
ঘোড়া |
++ |
++++ |
|
|
IgG2b |
+++ |
+++ |
শূকর |
+++ |
+++ |
|
|
IgG3 |
++ |
+++ |
ভেড়া |
+/- |
++ |
|
|
আইজিএম |
+/- |
- |
++++:স্ট্রং বিং |
|||
|
ইঁদুর |
IgG1 |
- |
+ |
++~+++: মাঝারি বাঁধাই |
||
|
IgG2a |
- |
++++ |
+: দুর্বল বাঁধাই |
|||
|
IgG2b |
- |
++ |
+/-:দুর্বল বা কোন বাঁধাই নেই |
|||
|
IgG2c |
+ |
++ |
-:কোন বাঁধাই নেই |
|||
|
আইজিএম |
+/- |
- |
||||
শুধুমাত্র গবেষণা ব্যবহারের জন্য। ডায়াগনস্টিক বা থেরাপিউটিক পদ্ধতিতে ব্যবহারের জন্য নয়!
গরম ট্যাগ: ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন কিট (প্রোটিন একটি অ্যাগারোজ), চায়না ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন কিট (প্রোটিন একটি অ্যাগারোজ) নির্মাতারা, সরবরাহকারী, কারখানা
