এজিং সেল -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং কিট

অধিকাংশ স্বাভাবিক কোষের বিভাজন ক্ষমতা সীমিত। যখন তারা বিভাজন করতে পারে না, তখন তারা বার্ধক্যের একটি অবস্থায় প্রবেশ করে, যাকে সেল সেন্সেন্স বলা হয়। সেল সেন্সেন্স হল একটি কোষের বৃদ্ধির সম্ভাবনাকে নিয়ন্ত্রণ করার গ্যারান্টি মেকানিজম, যার অর্থ সাধারণত প্রতিলিপিক সেন্সেন্স। সীমিত সংখ্যক বিভাজনের পর স্বাভাবিক কোষগুলি বিভাজন বন্ধ করে দেয় এবং অপরিবর্তনীয় বৃদ্ধি আটকে যায়। এই সময়ে, কোষগুলি এখনও জীবিত আছে, কিন্তু কোষের আকারবিদ্যা এবং শারীরবৃত্তীয় বিপাকীয় কার্যকলাপে উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন রয়েছে, যা সাধারণত বৃহত্তর কোষের আয়তন এবং বার্ধক্যের সাথে যুক্ত -গ্যালাক্টোসিডেস সক্রিয়করণ দ্বারা উপস্থাপিত হয়। -গ্যালাক্টোসিডেস কোষের লাইসোসোমে একটি হাইড্রোলাইটিক এনজাইম। এটি সাধারণত pH 4 এ সক্রিয় থাকে। এই কিটটি বার্ধক্যজনিত টিস্যু বা কোষকে বার্ধক্যের সাথে সম্পর্কিত -গ্যালাক্টোসিডেস কার্যকলাপ স্তরের আপ-নিয়ন্ত্রণের বিরুদ্ধে দাগ দেওয়ার এই ঘটনা এবং নীতির উপর ভিত্তি করে তৈরি করা হয়েছে। নির্দিষ্ট প্রতিক্রিয়া নীতি হল যে X-গ্যালটি সাবস্ট্রেট হিসাবে ব্যবহৃত হয় এবং সেন্সেন্ট সেল নির্দিষ্ট -গ্যালাক্টোসিডেস নীল পণ্য তৈরি করতে সাবস্ট্রেটকে অনুঘটক করে, যা কোষের সাইটোপ্লাজমে নীল পলল দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়, যা হালকা মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করা যায়। . প্রতিটি নমুনার জন্য স্টেনিং দ্রবণের পরিমাণ 1 মিলি, সেই হিসাব অনুযায়ী কিটটি 100টি নমুনার দাগ সম্পূর্ণ করতে পারে।

ভেজা বরফ পরিবহন; আলো থেকে 2-8 ডিগ্রি দূরে স্টোর করুন, 12 মাসের জন্য বৈধ। যদি X-Gal পাউডার একটি দ্রবণে প্রস্তুত করা হয়, তবে এটি ছোট অংশে বিভক্ত এবং -20 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়, যা 3 মাসের মধ্যে কার্যকর হয়।

বিকারক প্রস্তুতি

1. আপনার নিজস্ব PBS বাফার প্রস্তুত করুন (G4202 প্রস্তাবিত).

১ } ডিগ্রী আলো থেকে দূরে। বারবার জমাট বাঁধা এবং গলানো এড়িয়ে চলুন।

3. নীচের সারণীতে অনুপাত অনুযায়ী -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং দ্রবণ প্রস্তুত করা। 6-কূপ প্লেটে সংষ্কৃত কোষের জন্য, 10-1.5 মিলি স্টেনিং ওয়ার্কিং সলিউশন প্রতি কূপ, এবং 12-ওয়েল প্লেটের জন্য, 0৷{8} }}। বর্জ্য এড়াতে নমুনার আকার অনুযায়ী স্টেনিং দ্রবণ প্রস্তুত করা হয়েছিল।

1. অনুগত কোষ জন্য

(1) ভাল প্লেটগুলিতে সংষ্কৃত কোষগুলি (বা সেল ক্রলিং শীটগুলি) 6-এস্পিরেটেড হয়েছিল এবং সেল কালচার মিডিয়ামটি সরিয়ে দেওয়া হয়েছিল, পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং 1 মিলি-গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং ফিক্সিং দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল, এবং কোষগুলি ঘরের তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য স্থির।

(2) স্থির দ্রবণটি বাতিল করা হয়েছিল, এবং কোষগুলি প্রতিবার 3 বার, 2 মিনিটের জন্য পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল।

(3) পিবিএস একটি পাইপেট দিয়ে স্তন্যপান দ্বারা অপসারণ করা হয়েছিল, এবং প্রতিটি কূপে 1 মিলি-গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং কার্যকরী দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল এবং 2 ঘন্টা থেকে রাতারাতি 37 ডিগ্রিতে ইনকিউব করা হয়েছিল। দ্রষ্টব্য: কার্বন ডাই অক্সাইড ইনকিউবেটরে 37 ডিগ্রীতে ইনকিউবেট করবেন না। স্টেনিং সময়কালে, রঙের বিকাশ সময়মত পর্যবেক্ষণ করা উচিত। যদি নমুনায় -galactosidase-এর অভিব্যক্তি বেশি হয়, তাহলে কয়েক ঘণ্টার মধ্যে স্টেনিং সম্পূর্ণ করা যেতে পারে। যদি -গ্যালাক্টোসিডেস এক্সপ্রেশন কম হয়, তাহলে ইনকিউবেশনের সময়টি যথাযথভাবে বাড়ানো উচিত, এই সময়ে তরল বাষ্পীভবন যাতে দাগ লাগার ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করতে না পারে তার জন্য কূপ প্লেটটিকে প্লাস্টিকের মোড়ক বা প্যারাফিল্ম দিয়ে সিল করা উচিত।

(4) সাধারণ হালকা মাইক্রোস্কোপের অধীনে, ইতিবাচক কোষগুলির রঙের বিকাশের পরে স্টেনিং দ্রবণটি সরানো হয়েছিল। নিউক্লিয়াস কাউন্টারস্টেইন করার প্রয়োজন হলে, অল্প পরিমাণে নিউক্লিয়ার ফাস্ট রেড দ্রবণ যোগ করুন (G1035 সুপারিশ করা হয়) কক্ষগুলিকে ঢেকে রাখার জন্য ওয়েল প্লেটে রাখুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় 3 মিনিটের জন্য দাগ রাখুন, দাগের দ্রবণটি সরান এবং পিবিএস দিয়ে কয়েকবার ধুয়ে ফেলুন।

(5) কোষগুলিকে ঢেকে রাখতে 2 এমএল পিবিএস যুক্ত করা হয়েছিল এবং দাগ দেওয়া সম্পূর্ণ হয়েছিল। নমুনাটি 1 সপ্তাহের জন্য 4 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা যেতে পারে। বা কোষগুলিকে ঢেকে রাখতে 70% গ্লিসারল যোগ করুন, 4 ডিগ্রি দীর্ঘ সময়ের জন্য সংরক্ষণ করা যেতে পারে। যদি এটি সেল ক্লাইম্বিং শীট হয়, ক্লাইম্বিং শীটটি সম্পূর্ণরূপে শুকানো যেতে পারে, নিরপেক্ষ গাম সীল শীট ড্রপ করার পরে জাইলিন স্বচ্ছ, একটি দীর্ঘ সময়ের জন্য সংরক্ষণ করা যেতে পারে।

2. হিমায়িত বিভাগের জন্য

(1) হিমায়িত অংশগুলিকে 10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় পুনরায় গরম করুন। টিস্যু স্ট্রোক সঙ্গে টিস্যু বৃত্ত.

(2) টিস্যুকে সম্পূর্ণরূপে ঢেকে রাখার জন্য টিস্যুতে সঠিক পরিমাণে -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং ফিক্সিং দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল এবং 20 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় সমাধানটি স্থির করা হয়েছিল।

(3) টিস্যু বিভাগগুলি পিবিএস-এ 3 বার, প্রতিবার 5 মিনিটের জন্য ভিজিয়ে এবং ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।

(4) আলো এড়াতে বিভাগগুলি একটি ভেজা বাক্সে স্থাপন করা হয়েছিল এবং টিস্যুটিকে সম্পূর্ণরূপে ঢেকে রাখার জন্য টিস্যুতে উপযুক্ত পরিমাণে -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল। ভেজা বাক্সটি 37 ডিগ্রিতে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং প্রতি 2 ঘন্টা অন্তর একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে রঙের বিকাশ পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। যদি কোনও রঙের বিকাশ পরিলক্ষিত না হয়, টিস্যুর সেনসেন্ট কোষগুলি রঙ না দেখানো পর্যন্ত সংস্কৃতিটি অব্যাহত ছিল। যদি নমুনাটি রাতারাতি ইনকিউবেট করতে হয়, তাহলে ট্যাবলেটগুলিকে বাষ্পীভূত এবং শুকানো থেকে স্টেনিং দ্রবণ প্রতিরোধ করতে পর্যাপ্ত পরিমাণে -গ্যালাকটোসিডেস স্টেনিং দ্রবণ যোগ করতে হবে।

(5) টিস্যুতে রঙ হওয়ার পরে, স্টেনিং দ্রবণটি সরানো হয়েছিল, এবং বিভাগগুলিকে পিবিএস-এ ডুবিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপরে বিশুদ্ধ জলে ডুবিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।

(6) (ঐচ্ছিক) নিউক্লিয়ার ফাস্ট রেড দ্রবণ যোগ করুন (G1035 সুপারিশ করা হয়) 3 মিনিটের জন্য এবং 3 বার ধুয়ে ফেলুন।

(7) বিভাগগুলি 2 বার পরম ইথানল দিয়ে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল, তারপর প্রতিবার 5 মিনিটের জন্য জাইলিন দিয়ে স্বচ্ছ, এবং তারপর নিরপেক্ষ গাম ড্রপ দিয়ে সিল করা হয়েছিল।

3. স্টেনিং ফলাফল

সেন্সেন্ট কোষের সাইটোপ্লাজম বিক্ষিপ্ত নীল।

1. এক্স-গাল দ্রবণটি ব্যবহার করার আগে ঘরের তাপমাত্রায় গলানো এবং সম্পূর্ণরূপে মিশ্রিত করা উচিত।

2. -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং দ্রবণ A এবং B ব্যবহারের আগে ঘরের তাপমাত্রায় পুনরুদ্ধার করা উচিত এবং প্রস্তুত স্টেনিং দ্রবণটি ব্যবহারের আগে বৃষ্টিপাত ছাড়াই পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা উচিত।

3. সেনসেন্ট কোষের -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং প্রতিক্রিয়া নির্দিষ্ট pH অবস্থার উপর নির্ভরশীল, তাই এটি একটি CO-তে ইনকিউবেট করা যায় না₂রঙের বিকাশের জন্য ইনকিউবেটর, অন্যথায় এটি স্টেনিং দ্রবণের পিএইচকে প্রভাবিত করবে এবং স্টেনিং ব্যর্থতার দিকে পরিচালিত করবে।

4. ডাইং দ্রবণ প্রস্তুত করার সময়, অনুগ্রহ করে পলিস্টেরিন (পিএস) এর পরিবর্তে পলিপ্রোপিলিন (পিপি) বা কাচের তৈরি ভোগ্য সামগ্রী বেছে নিন।

5. রঙের বিকাশ 2 ঘন্টা-রাতারাতি রঙ বিকাশের সময়কালে বেশ কয়েকবার পর্যবেক্ষণ করা উচিত, খুব কম সময় নেতিবাচক ফলাফলের দিকে নিয়ে যেতে পারে; অত্যধিক সময় মিথ্যা ইতিবাচক হতে পারে. ক্রোমোজেনিক সময়টি নমুনায় থাকা গ্যালাকটোসিডেসের পরিমাণের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত।

6. স্টেনিং দ্রবণ প্রস্তুত করার আগে, স্টেনিং দ্রবণ A এর pH মান পরীক্ষা করুন। যদি এটি 6 না হয়।{2}} (যা সঞ্চয়ের অবস্থার কারণে পরিবর্তিত হতে পারে), pH মান 6 এ সামঞ্জস্য করুন।{4} } ব্যবহারের আগে HCl বা NaOH দিয়ে।

7. - টিস্যু বিভাগগুলির গ্যালাকটোসিডেস স্টেনিংয়ের জন্য নমুনাগুলির উচ্চ প্রস্তুতির প্রয়োজন, যা -80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা উচিত এবং যত তাড়াতাড়ি সম্ভব পরীক্ষা করা উচিত। কারণ -গ্যালাক্টোসিডেস নিষ্ক্রিয় করা খুব সহজ, অনুপযুক্ত স্টোরেজ বা নমুনার খুব বেশি সময় এনজাইম নিষ্ক্রিয় হতে পারে, তারপরে কোনও ইতিবাচক দাগ হয় না।

8. অনুগ্রহ করে অপারেশনের সময় একটি ল্যাব কোট এবং ডিসপোজেবল গ্লাভস পরিধান করুন

ছবি:

Fig.1WI-38 কোষগুলি -গ্যালাক্টোসিডেস কিট দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। বাম চিত্রটি বিভাজন এবং বিস্তার ক্ষমতা ছাড়াই সেন্সেন্স WI-38 কোষ দেখায় কিন্তু এখনও জীবিত। দাগ দেওয়ার পরে, ইতিবাচক স্টেনিং কোষগুলি 95% এর বেশি ছিল। ডানদিকের ছবিটি 3টির কম প্যাসেজ সহ নতুন পুনরুজ্জীবিত WI-38 কোষগুলি (প্রাথমিক উত্তরণ) দেখায় এবং দাগের পরে কোনও সুস্পষ্ট ইতিবাচক কোষ নেই৷

শুধুমাত্র গবেষণা ব্যবহারের জন্য!

গরম ট্যাগ: বার্ধক্য সেল -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং কিট, চীন বার্ধক্য সেল -গ্যালাক্টোসিডেস স্টেনিং কিট প্রস্তুতকারক, সরবরাহকারী, কারখানা